背景介绍：Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus（SFTSV）发热伴血小板减少综合征病毒，属于布尼亚病毒科（Bunyavirales） 的白蛉病毒属（Bandavirus），是一种单股负链RNA病毒。主要通过蜱虫叮咬（如长角血蜱 Haemaphysalis longicornis） 传播，也可能通过接触患者血液/分泌物发生人际传播。由于缺乏特殊的抗SFTSV药物，存在全球性致死率高的风险。
布帕伐醌（Buparvaquone， BPQ）是第二代羟基萘醌类药物，作为一种用于治疗牛肠杆菌病的抗原虫药物上市。它代谢缓慢，半衰期长，毒性低，刺激性小，残留少，是一种安全的商业药物，用于兽医治疗。大量研究证明，BPQ对许多原生动物，如巴西芽孢杆菌、巴西孢子菌和贝斯诺提菌都有较强的抑制活性，也能抑制猴痘病毒等几种病毒的感染。但是对于BPQ的作用机制尚未完全阐明。
上海海军第十四军医大学海军医学院戚中田教授团队从FDA批准的1400个小分子中筛选出并确定BPQ是一种有效的SFTSV感染抑制剂；进一步的研究揭示了BPQ与病毒包膜糖蛋白Gc在病毒-宿主膜融合过程中相互作用的分子机制；并用小鼠感染模型和目标器官的iPSC衍生的器官中验证了其独特疗效，这代表着未来SFTSV治疗干预中潜在的有效和安全治疗选择。
预发表期刊：SSRN
样本类型：细胞模型、小鼠模型、类器官
研究手段：Lip-MS、DARTS、SPR、BLI、分子对接和分子动力学模拟，百泰派克提供Lip-MS及质谱检测。
研究结果：
1、筛选潜在的抗SFTSV化合物
利用优化的细胞感染模型，筛选了包含1400个小分子的FDA批准文库，在每个药物浓度为10 μM的条件下，评估其潜在的抗SFSV活性，并据此进一步阐明了优化化合物的抗病毒作用和机制(图1a)。
图1 FDA批准的抗SFTSV药物化合物文库的高通量筛选
初步筛选后，共有8个化合物在第二次平行筛选的中心浓度为10 μM时表现出较强的抗病毒活性(抑制率大于95%)(图1b)。其中BPQ在Huh7及THP-1、Vero和Raw264.7中表现出最佳的疗效和低细胞毒性(图1c-d)。
图1 BPQ表现出最佳的疗效和低细胞毒性
2、BPQ最有可能在内化后过程中抑制病毒进入
为了解BPQ对SFTSV的抗病毒作用，先设计了Huh7被病毒感染不同时间后受BPQ处理，结果表明，BPQ在0-4h内显著抑制SFTSV感染，尤其是在0-2小时(图2a)。之前研究表明，SFTSV的复制周期为5 h，因此推测BPQ可能在病毒感染的早期阶段，即病毒进入阶段，发挥抗病毒作用，并且发现0.08 μM BPQ处理对SFTSV几乎没有毒力（图2b）。
随后，检测了BPQ对病毒结合和内化（病毒粒子运输到细胞质中）的影响。文章将Huh7与SFTSV和BPQ或载体在4℃共孵育1.5 h，然后去除游离病毒颗粒，用RT-qPCR检测结合病毒，结果显示BPQ不影响SFTSV结合过程（图2c）；之前研究表明SFTSV通过网格蛋白介导的内吞途径内化，这与文章结果一致，即在网格蛋白介导的内吞作用抑制剂pitstop 2 （PP2）存在时，SFTSV感染被抑制，而不是小窝介导的内吞作用或Filipin III或amiloride的微胞吞作用抑制剂（图2d），为了确定BPQ是否阻碍SFTSV内化，本实验使用荧光标记转铁蛋白（TF，由网格蛋白介导的内吞作用内化的经典分子），结果表明BPQ处理没有改变TF的摄取，而PP2显著降低细胞内荧光标记的TF，表明BPQ也没有阻碍SFTSV内化（图2e）。
图2 BPQ对SFTSV侵袭早期的影响
3、BPQ干扰病毒膜融合过程，但不影响内体酸化
在病毒内化之后，SFTSV启动了膜融合过程。文章评估了BPQ对病毒膜融合的影响。先进行了动力学试验，以确定BPQ的抑制模式：分别用BPQ、bafilomycin A1、NH4Cl对感染的Huh7进行不同时间的处理，BPQ表现出与bafilomycin A1和NH4Cl等公认的膜融合抑制剂相似的抑制模式，并且仅在病毒感染的初始阶段发挥抗病毒活性，提示BPQ可能抑制病毒膜融合（图3a）。
后面利用DiO标记的SFTSV （SFTSVDiO）实时监测病毒-宿主细胞融合。荧光强度的增加的现象定义为膜融合，这是由于病毒粒子-宿主膜融合过程中DiO的稀释而引起的猝灭。BPQ处理组与bafilomycin A1和NH4CI相比，荧光强度有明显甚至更显著的降低（图3b-c）。由于膜融合的最后一步是融合孔的形成和内体RNA的释放，文章也研究了BPQ是否对它们有影响。用不同的化合物处理SFTSV感染的Huh7，然后用冷PBS和高盐、高ph缓冲液彻底清洗，使用洋地黄苷对细胞进行渗透，使细胞质成分（包含经过完全膜融合的病毒释放的RNA）扩散到细胞质溶胶中，收集并检测细胞质和膜组分，通过WB分析评估细胞质和细胞膜分离效率，其中GAPD和Rab7分别代表细胞质和膜组分（图3d）。结果显示，与膜融合抑制剂一致，BPQ显著降低了胞内体释放的细胞质病毒RNA水平（图3e）。
研究证实，SFTSV 膜融合过程以pH依赖的方式发生在核内体晚期，其中pH必须降低到约5.6才能触发病毒糖蛋白重塑，暴露Gc蛋白融合环的活性位点。因此，文章检测了BPQ对内体酸化的影响。将SFTSV 感染的Huh7与化合物在37℃下孵育2 h，然后将上清替换为含有Lysotracker Deep Red试剂的新鲜培养基，以促进细胞酸性细胞器的可视化。与bafilomycin A1和NH4Cl相比，BPQ和空白对照组的荧光强度无明显差异（图3f），表明BPQ不影响内体酸化。
图3 BPQ受损的SFTSV膜融合过程
4、大规模筛选与BPQ相互作用的靶蛋白-Lip-MS
为了阐明BPQ抑制SFTSV膜融合的具体机制，文章用SFTSV感染的Huh7裂解液与指定浓度的BPQ孵育，用Lip-MS筛选与BPQ相互作用的蛋白（图4a）。与对照组相比，4 μM BPQ处理组共鉴定出2067个上调和1469个下调的DQPs，40 μM BPQ处理组鉴定出2171个上调和1425个下调的DQPs。然后根据BPQ浓度，采用分层聚类法分析DQP的定量变化（图4c）。
DPQs的表达模式被分为4个簇，其中簇2和簇4的特征为增加模式，因为与对照组相比，在指定浓度的BPQ下，暴露肽的数量增加，这表明该化合物覆盖了更多相关肽，保护它们免受蛋白酶裂解（图4d）。最重要的是，4 μM BPQ处理组中有5个肽段和40 μM BPQ处理组中有3个肽段来自SFTSV Gc蛋白，该蛋白是SFTSV膜融合的关键病毒蛋白。此外，这5个多肽都在上调的暴露肽中（图4b），其中2个遵循簇4模式。结合前期BPQ抑制SFTSV膜融合过程的结果，推测BPQ可能通过与病毒Gc蛋白相互作用抑制病毒感染。
图4 Lip-MS分析大规模筛选与BPQ相互作用的靶蛋白
5、BPQ通过与病毒Gc直接相互作用抑制SFTSV膜融合过程
为了验证BPQ和Gc蛋白之间的潜在相互作用，文章进行了药物亲和力响应靶稳定性（dart）测定。结果显示，BPQ显著抑制pronase对病毒Gc蛋白的蛋白水解，且呈剂量依赖性，提示BPQ可能与Gc结合（图5a）。更重要的是，通过表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉法（BLI）测定化合物与靶蛋白的结合亲和力，均表明BPQ和Gc蛋白之间存在较强的直接相互作用。
分子对接推测BPQ与Gc蛋白之间潜在的相互作用。三维结构模型表明，BPQ能够渗透到蛋白口袋内部，并与Gc II结构域的氨基酸残基形成广泛的相互作用（图5e）。BPQ与蛋白质的结合能和对接分数分别为-56.26 kcal/mol和-7.186，表明有较强的相互作用。在Lip-MS检测中，一个上调的DQP(K631-R641)（图5e所示的粉色肽）位于BPQ- Gc binding区域，形成疏水相互作用和静电相互作用（图5e）。结构域II对于Gc的生物学功能至关重要，因为它包含负责介导膜融合的融合环。通过分子动力学模拟（MDS）技术进一步评价了BPQ与Gc的结合相对稳定。
图5 BPQ与病毒Gc蛋白的相互作用
6、BPQ在体内对SFTSV全身感染具有保护作用
文章对BPQ的体内抗病毒活性也进行了评价。文章采用干扰素受体缺陷型（A129-/-）小鼠模型（该模型是经验证的致死性SFTSV感染模型）。结果显示，感染前24 h用BPQ处理小鼠，存活率提高了约30%（图6a），存活小鼠的体重均逐渐恢复到正常水平（图6b）。BPQ治疗还显著缓解了疾病发展早期的血小板减少症（图6c），这是SFTSV严重程度的关键指标。此外，BPQ治疗后，在整个感染过程中，脾脏、肝脏、结肠等靶器官的病毒载量也显著降低（图6d、图6e、图6f）。同样，免疫荧光也证实了脾脏SFTSV感染的减少（图6g），组织病理学分析显示BPQ处理小鼠的病理损伤较轻，脾脏白色髓萎缩减轻（图6h）。
文章也用C57BL/6小鼠模型评估了BPQ的保护作用。C57BL/6小鼠在疾病早期表现出典型的血小板减少和SFTSV器官感染的临床症状。BPQ处理减轻了感染小鼠的血小板减少（图6i）的情况；脾脏的病毒载量和蛋白表达（图6j和图6k）也减少；通过组织病理学分析，脾脏出现了较轻的病理性损伤（图6l）。结果表明BPQ在体内对SFTSV感染具有一定的保护作用。
图6 BPQ在SFTSV感染的A129−/−和C57BL/6小鼠中的表现出抗病毒活性
7、BPQ对人类来源的肝脏和结肠类器官具有有效的抗病毒活性
文章将成熟且质量合格的肝脏和结肠类器官在指定浓度的BPQ存在下37℃用SFTSV孵育24小时，后回收类器官，采用全挂载免疫荧光染色法检测病毒核蛋白（NP）的感染情况。结果表明，BPQ在成熟的人肝脏类器官中以剂量依赖的方式抑制SFTSV感染，这一点通过检测白蛋白（ALB）水平得到证实（图7a）。BPQ浓度为4 μM时，对结肠类器官的抗病毒作用更为明显，几乎检测不到病毒NP；结肠特异性标记物SATB2在感染后大量减少，提示病毒与宿主因子之间可能存在相互作用（图7b）。
图7 BPQ在SFTSV感染的人iPSC衍生的肝脏和结肠类器官中的抗病毒活性
研究结论：
SFTSV感染的新出现和不断上升的发病率促使开发新型有效、安全的抗SFTSV药物。在本研究中，首次发现抗寄生虫药物BPQ具有低毒性、高抗病毒活性。体外实验表明，BPQ通过与病毒Gc蛋白直接相互作用抑制SFTSV感染，从而干扰病毒进入期的膜融合过程。BPQ对感染小鼠也表现出最佳的保护作用，可使免疫缺陷小鼠的存活率提高约30%并观察到BPQ对人类iPSC衍生的肝脏和结肠类器官病毒感染的抑制效果令人满意，显示出良好的临床应用前景。
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